U.D. 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE (secondo Shaeffer e Fulton)

OBIETTIVO:
Osservare la presenza di endospore e spore libere.
PRINCIPIO:
Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il colorante anche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore del colorante di contrasto (safranina).

MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Verde malachite 5%, safranina, olio da immersione
TERRENI DI COLTURA
Agar al manganese
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno, piastre sterili, beuta, provette
STRUMENTI
Microscopio, autoclave, termostato, bilancia, bunsen
  Agar al manganese
  Nutrient broth 8 g
Agar 20 g
MnCl2 1% 0,5 ml
Acqua 1000 ml
Unire al brodo l’agar e scaldare, aggiungere poi 0,5 ml di MnCl2 1% in acqua.

 

METODICA

(I FASE) a cura dell’insegnante

 

 

 Preparare delle provette con 16-18 ml di agar al manganese.

 

 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.

 

 Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare.

 

 Seminare per striscio un’ansata della coltura in esame.

Incubare a 35° per 18-24 h.

 

 

(II FASE) a cura dello studente - colorazione

 

Allestire e fissare un vetrino con una delle colonie ottenute nella I FASE.

 

 

 Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra una vaschetta contenente acqua la quale verrà portata all’ebollizione.
Colorare abbondantemente con verde malachite, lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa per 3-5’ e aggiungere ancora il colorante facendo attenzione che il vetrino non rimanga a secco.
(per evitare che il vetrino cada nella vaschetta trattenerlo con una pinza di legno)

Lavare con acqua e colorare con safranina per 5’.
Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente.

 

- osservazione al microscopio

 

 

 

 

 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.