U.D. 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI
SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

OBIETTIVO:
Verificare l’adattamento di alcune specie microbiche a condizioni differenti di ossigenazione e di pH del mezzo di crescita.
PRINCIPIO:
Ogni specie microbica presenta esigenze nutrizionali e colturali diverse. Variando in modo controllato alcuni fattori ambientali si può valutare la risposta di ciascuna specie microbica in esame attraverso l’osservazione della crescita in coltura.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Brodocolture di Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae
MATERIALI CHIMICI
Reattivi per anaerobiosi (catalizzatori, indicatori), cartina indicatrice (test a)

Soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e
NaOH 0,1 M (100 ml) (test b)
TERRENI DI COLTURA
Glucose agar (test a)

TSB (test b)
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, beker 100 ml, piastre sterili con setto,
ansa, piastre sterili, pipette sterili da 1 ml
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, phmetro, bunsen

 

METODICA

test a) Influenza dell’ossigeno atmosferico sulla crescita Ricerca di aerobi, anaerobi e anaerobi facoltativi

 

 

 

 Sciogliere il terreno per una prova in doppio, più il controllo.

 

 

 Distribuire in provette, controllare il pH con la cartina indicatrice e autoclavare.

 

 

 Piastrare e raffreddare il terreno.

 

 

 Seminare in ciascuna metà della piastra, in maniera sterile, mediante striscio, l’inoculo dei due ceppi batterici. Una piastra va messa in termostato e l’altra in giara.

 

 

 

Giara:
sistemare le piastre capovolte nella giara, inserire l’indicatore per anaerobiosi e il reattivo per eliminare l’ossigeno (il reattivo va attivato aggiungendo 10 ml di acqua nella bustina operando lontano dalla fiamma per la presenza di idrogeno altamente infiammabile); la reazione viene portata a termine in circa 60’, dopodiché controllare la pressione nel manometro (1 atm. circa). Dopo 2-3 ore controllare se l’indicatore per l’anaerobiosi è virato al rosso.


Riporre la giara e la seconda serie di piastre in termostato a 37° per 48 h. Dopo incubazione aprire la giara sotto cappa, controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondo la seguente scala:
- = assenza di crescita
+ = crescita scarsa
++ = crescita normale
+++ = crescita abbondante
NB: il catalizzatore è situato nell’apposita sede posta sotto il coperchio della giara; tra un impiego e l’altro va asciugato riscaldandolo in stufa a 160° per 90’.

METODICA

test b) Influenza del pH del mezzo sulla crescita Si verifica l’influenza del pH sulla crescita coltivando i batteri in terreni in cui viene variato il pH per aggiunta di acidi o di basi.

 

 

 Sciogliere il terreno, distribuirlo in 4 beute.

 

 
Preparare le soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) e correggere il pH in ognuna delle beute con i valori 3,0-4,5-7,0-9,0 controllandole con il phmetro.
PHMETRO
Accendere il pHmetro almeno 10’ prima dell’uso ed effettuare la calibrazione. Selezionare il tasto pH e automatico, inserire l’elettrodo nel campione a pH 7. Pigiare il tasto cal e attendere che lo strumento si stabilizzi. Lavare e asciugare l’elettrodo e ripetere l’operazione con il campione a pH 4 o 10. Effettuare la lettura dei vari campioni pigiando il tasto read o = lavando accuratamente l’elettrodo tra una lettura e l’altra.

 

Distribuire 10 ml in ogni provetta in modo da ottenere 4 provette per ogni prova. Sterilizzare a 121° per 15’ e ricontrollare infine il pH.

 

 

 Seminare 1 ml delle due brodocolture in ogni provetta, incubare sia i tubi seminati che quelli non seminati a 36° per 24-48 h.

 

Controllare la crescita nei tubi e registrare i risultati secondo la seguente scala:
- = assenza di crescita
+ = crescita scarsa
++ = crescita normale
+++ = crescita abbondante