U.D. 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA

OBIETTIVO:
Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa.
PRINCIPIO:
Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione e incubata, si riproduce formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si può risalire al numero di microrganismi presenti in un volume noto del campione.

MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture batteriche
TERRENI DI COLTURA
Nutrient agar
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, piastre sterili, ansa, pipette sterili da 1 ml
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, bunsen

METODICA

(I FASE) A CURA DELL’INSEGANTE

1) conta dei batteri mediante semina per inclusione in piastra (previa diluizione in serie)

 

 

 

 Preparare il terreno agar nutrient e sterilizzarlo.

 

 

 Partendo dalla sospensione in esame, preparare diluizioni scalari 1:10, 1:100, 1:1000 come segue: prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml del campione in esame e porlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica sterile. Ripetere l’operazione per le successive diluizioni cambiando opportunamente la pipetta ogni volta.

Numerare 4 piastre

10° campione non diluito

10-1 fattore di diluizione 1:10

10-2 fattore di diluizione 1:100

10-3 fattore di diluizione 1:1000

quindi seminarci 0,1 ml di ogni diluizione.

Versare il terreno sterile mantenuto fuso a b.m. nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con un movimento rotatorio, lasciar solidificare.

 

 

 Incubare a 37° per 48h poi contare al contacolonie, le colonie ben isolate quando sono comprese tra 100 e 300.
Le colonie crescono sia in superficie che in profondità e se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno in progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e più piccole dove il numero è maggiore.

 

Predisporre una tabella per i risultati

 

 

n. colonie
n. colonie
n. colonie
n. colonie
10°
10-1
10-2
10-3
Campione 1 - - - -
Campione 2 - - - -
Campione 3 - - - -

 



Dalla conta si risale al numero di batteri/ml nelle sospensione in esame mediante la seguente formula:

N= n*1/d*1/V

N= numero di germi/ml del campione puro

n= numero di colonie nella piastra

1/d= reciproco della diluizione dell’inoculo in quella piastra

1/V= reciproco della frazione di volume considerato (1ml) utilizzato per l’inoculo1/10 di ml