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U.D. 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA

OBIETTIVO:
Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica delle membrane filtranti)

PRINCIPIO:
Filtrando volumi determinati di liquidi attraverso membrane sterili, con una porosità inferiore a 1 ?m, e ponendo tali filtri sulla superficie di terreni agarizzati in piastra, dopo incubazione, si otterranno colonie isolate che possono venire contate.

MATERIALI E STRUMENTI:

TERRENI DI COLTURA
PCA, ENDO broth MF, Faecal coliform broth, Azide maltose agar

VETRERIA, ...
Pipette sterili da 1-10ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre sterili, filtri sterili con membrana da 0,2 microm

STRUMENTI
Apparato per la filtrazione, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, cappa sterile, pompa da vuoto, bunsen

METODICA

Procedimento A (Conta batterica totale)

Sterilizzare dentro una busta per autoclave l’apparato di filtrazione (composto dall’imbuto, il porta filtro, la beuta codata), pinze di metallo, un cilindro da 100 ml, 5 matracci da 100 ml, pipette graduate da 10 ml.

Sterilizzare e piastrare 6 piastre con il terreno PCA. Sterilizzare una beuta contenente 500 ml di acqua distillata per le diluizioni del campione.

Sotto la cappa sterile preparare le diluizioni del campione di acqua.
(2 campioni 1:10) Prelevare 10 ml di campione e metterlo in tre matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile. Un matraccio servirà per la diluizione successiva .
(2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo in due matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile.

Montare l’apparato di filtrazione inserendo tra l’imbuto e il porta filtro l’apposito filtro sterile, collegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare i campioni di acqua partendo da quelli più diluiti. Dopo la prima filtrazione si toglie il filtro e lo si depone sulla superficie della piastra di PCA. Si procede così per tutti e sei i campioni (campioni 100 –10-1- 10-2).

Mettere le piastre capovolte in termostato per 24h; una piastra a 22° e l’altra a 37° per ogni diluizione.

METODICA

Procedimento B (Individuazione coliformi totali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Endo broth agarizzato.
Incubare a 36° per 24h.

Procedimento C (Identificazione coliformi fecali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Faecal coliform broth agarizzato.
Incubare a 44° per 24h.

Procedimento D (Individuazione Streptococchi fecali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Azide
maltose agar.
Incubare a 36° per 48h.

Valutazione:

a) Per la conta batterica totale si prendono in considerazione tutte le colonie presenti sulla membrana dopo incubazione. Riportare il valore alle diluizioni eseguite. (valori guida: 10 colonie a 36°C, 100 colonie a 22°C/1 ml)

b) Per i coliformi totali contare le colonie rosse e tutte le colonie che presentano riflesso metallico (fucsina); queste ultime possono essere presumibilmente classificate come colonie di Escherichia coli. Altre colonie eventualmente presenti non vanno conteggiate. Riportare il valore a 100 ml di campione.

c) Per i coliformi fecali contare le colonie in grigio, grigio-blu e blu. Altri tipi di colonie eventualmente presenti non si contano. Riportare il valore a 100 ml di campione.

d) Per gli streptococchi fecali contare solo le colonie rosso, rosso-scuro, puntiformi (diametro max 1 mm) con contorni netti e cupoliformi. Ogni altro tipo di colonia non deve essere conteggiato. Riportare il valore a 100 ml di campione.

Risultati:	22°C	36°C	44°C
Carica batterica totale 100	………./ml	………./ml	-
10-2	………./ml	………./ml	-
10-1	………./ml	………./ml	-
Coliformi totali	-	………./100ml	-
Coliformi fecali	-	-	………./100ml
Streptococchi fecali	-	………./100ml	-