U.D. 4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA POTABILE

OBIETTIVO:
Valutare se il campione in esame corrisponde ai requisiti di potabilità dal punto di vista microbiologico.
PRINCIPIO:
Ricerca e quantificazione delle varie specie che rappresentano indicatori batterici di inquinamento e più precisamente:
- carica microbica totale
- coliformi totali e fecali
- streptococchi fecali

MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI CHIMICI
Cartine indicatrici
TERRENI DI COLTURA
PCA, Lactose broth, Brillant green bile broth, Azide dextrose broth, Ethyl violet azide broth
VETRERIA, ...
Pipette sterili da 10-1-0,1 ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre sterili
STRUMENTI
Centrifuga, bagnomaria, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, bunsen

 
  PRELIEVO DEI CAMPIONI
  Il prelievo viene effettuato con bottiglie sterili in vetro o in plastica con tappo a vite, chiusi da fogli di carta di alluminio. Il prelievo sarà effettuato dopo aver fatto defluire l’acqua per alcuni minuti. I campioni vanno sottoposti all’esame quanto prima, in ogni caso l’intervallo di tempo fra il prelievo e l’analisi non dovrà superare le 24h.

 

SCHEMA DI LAVORO

clicca per ingrandire lo schema

METODICA

a) CARICA MICROBICA TOTALE a 36° e 22°

 

 

 

Trasferire con pipette sterili, 1 ml del campione di acqua in 4 piastre, se il campione è molto contaminato procedere a diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000) con acqua dist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2).

 

 

 Piastrare con PCA mantenuto fuso in b.m. ruotare delicatamente le piastre per omogenizzare il campione nel terreno.

 

 

 Incubare 2 piastre a 36° per 48h e le altre 2 a 22° per 72h.

Osservare le colonie cresciute con il contacolonie, ricavare il valore medio su ogni coppia di piastre, esprimere il risultato come colonie su agar/ml a 36° e 22°C.

 

 

 

METODICA

b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test presuntivo)

c) STREPTOCOCCHI FECALI (test presuntivo)

 

 

 Preparare e sterilizzare (per i coliformi):
3 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione doppia.
6 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione normale.

 

 

 Preparare e sterilizzare (per gli streptococchi):
3 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione doppia.
6 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione normale.

Seminare 10 ml di campione nei 3 provettoni contenenti il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a concentrazione doppia.

Seminare 1 ml di campione nei 3 provettoni contenenti il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a concentrazione normale.

Seminare 0,1 ml di campione nei 3 provettoni contenenti il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a concentrazione normale.

 

 

 Incubare a 36° per 24-48 h tutti i test, leggere dopo 24 h considerando positive solo le colture che hanno crescita con sviluppo di gas e intorbidamento del terreno. Incubare di nuovo solo i tubi negativi per altre 24 h.

 

METODICA

b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test di conferma)

c) STREPTOCOCCHI FECALI (test di conferma)

 

 

 

 Preparare e sterilizzare:
tanti provettoni con campanella di durham quante sono le prove positive con 4 ml di Brillant green bile broth (per i coliformi) e altrettante con 5 ml di EVA broth (per gli streptococchi).

 

 

 Seminare 1 ansata di ogni brodocoltura positiva delle prove presuntive nei tubi contenenti il Brillant green e 3 ansate in quelli contenenti EVA broth.

 

 

 Incubare a 36° per 24h i coliformi totali,
a 44° per 24h i coliformi fecali,
a 36° per 48h gli streptococchi.
Osservare i risultati, la determinazione numerica dei batteri ricercati viene espressa rispetto al numero di tubi positivi (intorbidamento e produzione di gas per i coliformi, sedimento color porpora per gli streptococchi) e esprimere la concentrazione dei batteri come MPN/ml di campione, cioè di numero più probabile.

 

Tabella MPN
Numero tubi positivi su
MPN
per 100 ml
Limiti fiduciari
3 da 10 ml
3 da 1 ml
3 da 0.1 ml
inferiori
superiori
0
0
1
3
<0,5
9
0
1
0
3
<0,5
13
1
0
0
4
<0,5
20
1
0
1
7
1
21
1
1
0
7
1
23
1
1
1
11
3
36
1
2
0
11
3
36
2
0
0
9
1
36
2
0
1
14
3
37
2
1
0
15
3
44
2
1
1
20
7
89
2
2
0
21
4
47
2
2
1
28
10
150
3
0
0
23
4
120
3
0
1
39
7
130
3
0
2
64
15
380
3
1
0
43
7
210
3
1
1
75
14
230
3
1
2
120
30
380
3
2
0
93
15
380
3
2
1
150
30
440
3
2
2
210
35
470
3
3
0
240
38
1300
3
3
1
460
71
2400
3
3
2
1100
150
4800

 

Parametri microbiologici dalla Gazzetta Ufficiale – maggio 1985

Caratteristiche di qualità delle acque destinate al consumo umano
Parametro ed unità di misura
Valore guida
Valore limite
osservazioni
Coliformi fecali/100 ml
-
0
 Non più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di 2 campioni prelevati nello stesso punto possono eccedere tale limite. Comunque mai superiore a 5/100 ml.

Coliformi totali/100 ml
-
0

Conteggio colonie su agar/1 ml a 36°C

a 22°C

10

100

-

-

 Alte cariche batteriche richiedono indagini e accertamenti appropriati.
Streptococchi fecali/100 ml
-
0
 -