U.D. 4.6 ANTIBIOGRAMMA

OBIETTIVO:
Stabilire lo spettro di sensibilità di un determinato ceppo microbico a diversi antibiotici.
PRINCIPIO:
Come nella precedente esperienza (U.D. 4.5), la valutazione della sensibilità del ceppo microbico in esame a diversi antibiotici, si effettua misurando il diametro dell’alone di inibizione che si è formato intorno a dischetti contenenti quantità prestabilite e controllate di antibiotico (tecnica di Kirby-Bauer). L’interpretazione dei risultati la si ottiene consultando apposite tabelle che permettono di stabilire se il ceppo microbico è resistente, intermedio o sensibile ad un determinato antibiotico.

MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia Coli, Enterobacter aerogenes
MATERIALI CHIMICI
Standard MacFarland, dischi di antibiotici
TERRENI DI COLTURA
Trypticase Soy broth, Mueller Hinton agar
VETRERIA, ...
Piastre sterili, ansa, provette 16x100, tamponi sterili, pinze mettalliche, beker 100 ml, righello
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, bunsen
  Standard MacFarland
  0,5 ml di Bario cloruro 0,048M + 99,5 ml di Acido Solforico 0,35 N (0,99 ml/100ml di acido solforico, 0,117 g/10 ml di Bario Cloruro).
Tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml). La soluzione è stabile per circa 6 mesi. Agitare prima dell’uso.

 

METODICA

(I fase)

 

 

 Preparare il brodo.

 

 

 Distribuire 4-5 ml di brodo in ogni provetta.

 

 

 Preparare il terreno Mueller Hinton agar a doppio volume.

 

 

 Distribuire in provettoni con tappo metallico
(40 ml per provettone).

 

 

 Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.

 

(II FASE I parte)

 

 

 Piastrare il terreno Mueller Hinton agar in ambiente sterile.

 

(II FASE II parte)

 

 

 

 Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico in ogni
provetta contenente il brodo TSB.

 

 

 Incubare le provette a 37° per 18h.

 

(III fase I parte)

 

 

 

 Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità della brodocoltura con quella dello standard MacFarland, (tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml) usare brodo sterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.

 

(III FASE II parte)

 

 
Immergere un tampone sterile nella brodocoltura e seminare sulla superficie del terreno in maniera uniforme, ripetendo l’operazione più volte ruotando la piastra di 60°.

 

 

 Entro 15’ applicare sulla piastra seminata i dischi di antibiotici mediante pinze sterili (selezionare gli antibiotici in relazione al tipo di batteri). Disporre i dischi ad una analoga distanza tra loro.

 

 

 Incubare le piastre a 37° per 16-18 h.

 

(IV FASE)

 

 

 

 

Misurare con un centimetro il diametro degli aloni di inibizione sul fondo della piastra posta sopra una superficie luminosa. Interpretare i risultati in base allo schema di lettura.

 

Antibiotico
Diametro alone di inibizione
Resistente
Moderat. sensibile
Sensibile
Ampicillina (AM) (enterococchi, enterobatteri)
<11
12-13
>14
Ampicillina (AM) (stafilicocchi)
<20
21-28
>29
Acido nalidixico (NA)
<13
14-18
>19
Eritromicina (E)
<13
14-17
>18
Fosfomicina (FFL)
<10
11-14
>15
Gentamicina (GM)
<12
-------
>13
Penicillina G (P) (Stafilococchi)
<20
21-28
>29
Penicillina G (P)
(Altri microrganismi)
<11
12-21
>22