U.D. 6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO (Test di neutralizzazione)

OBIETTIVO:
Determinare la presenza o meno nel siero in esame di anticorpi anti O-streptolisinici e valutarne il titolo.
PRINCIPIO:
La O-streptolisina è una emolisina prodotta da Streptococcus pyogenes beta emolitico. La O-streptolisina provoca sulla membrana delle emazie dei fori dai quali fuoriesce l’emoglobina. Gli anticorpi che si fissano alla tossina, (reazione di neutralizzazione) impediscono l’evento. Come sistema rivelatore della presenza o meno di anticorpi nel siero si usano le emazie. Se i globuli rossi più il siero in esame, vengono lisati dall’aggiunta di O-streptolisina non si è verificata una reazione di neutralizzazione, dunque nel siero non sono presenti anticorpi anti O-streptolisinici. Viceversa l’assenza di lisi segnala la presenza di anticorpi capaci di legare e neutralizzare la tossina.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
O-streptolisina titolata, globuli rossi di coniglio al 5%
MATERIALI CHIMICI
Soluzione tampone a pH 6,5
VETRERIA, ...
Pipette in vetro o pipette automatiche, puntali, provette da sierologia, portaprovette

STRUMENTI
Centrifuga, bagnomaria

METODICA

 

 

Diluire il siero

1/10 = 0,2 ml di siero + 1,8 ml di soluzione tampone
1/100 = 0,5 ml siero 1/10 + 4,5 ml di soluzione tampone
1/500 = 1 ml siero 1/100 + 4 ml di soluzione tampone

 

 

 Lavare la sospensione di globuli rossi almeno 3 volte con il tampone, centrifugando ogni volta a 1500-2000 rpm per 5’. Dopo il lavaggio finale preparare la sospensione al 5% in tampone.

Disporre 14 provette come da schema:

 

 
1:10
1:100
1:500
controlli
provetta
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
siero diluito
0.8
0.2
1
0.8
0.6
0.4
0.3
1
0.8
0.6
0.4
0.2
-
-
tampone
0.2
0.8
-
0.2
0.4
0.6
0.7
-
0.2
0.4
0.6
0.8
1.5
1
reagente o-streptolisina
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
-
0.5
Agitare ed incubare a 37° per 15’
emazie al 5%
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agitare e incubare a 37° per 45’, ripetere l’agitazione dopo 15’. Centrifugare le provette per 1-2’ a 1000-1500rpm

 
Il titolo del siero in esame è espresso dalla più alta diluizione che è capace di inibire l’emolisi. L’emolisi nelle provette è caratterizzata dal colore rosso della soluzione in esame. Le unità anti-o-streptolisiniche sono espresse come il reciproco del titolo di anticorpi come nello schema:
provetta diluizione provetta diluizione
1 1/12 8 1/500
2 1/50 9 1/625
3 1/100 10 1/833
4 1/125 11 1/1250
5 1/166 12 1/2500
6 1/250 13 non vi deve essere emolisi
7 1/333 14 vi deve essere emolisi completa