AGAR BIOS SPECIAL LL

AZIDE DEXTROSE BROTH

Formula (grammi per litro)
Peptocomplex 15.0
Beef Extract 4.5
Glucose 7.5
Sodium Chloride 7.5
Sodium Azide 0.2
Preparazione
Sciogliere 34.7 g di polvere in 100 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire in tubi da 10 ml ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Per inoculi superiori a 1 ml per 10 ml di terreno, preparare il terreno a concentrazione doppia o multipla. pH finale 7.2±0.2.
Impiego
Azide Dextrose Broth è un terreno selettivo per la determinazione presuntiva degli streptococchi fecali nelle acque e negli alimenti: la composizione è conforme a quanto stabilito da OMS e APHA.
Eseguire il conteggio in tubi, secondo il metodo del numero più probabile; variare l'entità dell'inoculum (multipli o frazioni di 1 ml) in funzione del tipo di campione, allestendo almeno cinque tubi per ogni diluizione.
Usare come liquido per diluizione tampone di fosfati oppure una soluzione acquosa di peptone allo 0.5% (p/v). Incubare a 35°C per 24 ore, osservare se vi è sviluppo; in caso negativo protrarre l'incubazione per altre 24 ore.
Calcolare il risultato servendosi delle apposite tabelle ed esprimerlo come numero più probabile presuntivo. Confermare il risultato presuntivo trapiantando in Ethyl Violet Azide Broth

AZIDE MALTOSE AGAR (KF)

Formula (grammi per litro)
Peptocomplex 10
Yeast Extract 10
Sodium Chloride 5
Sodium Glycerophosphate 10
Maltose 20
Lactose 1
Agar Bios LL 15
Sodium Azide mg 400
Brom Cresol Purple 15
Preparazione
Sciogliere 71.4 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda, portare all'ebollizione sotto agitazione bollire per cinque minuti, raffreddare in bagnomaria a 50°C ed aggiungere, con le cautele dell'asepsi, 10 ml di una soluzione acquosa di 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC) all'1% sterilizzata per filtrazione; il terreno così preparato può essere conservato a 50°C per circa tre ore prima di essere versato nelle piastre. Le piastre preparate possono essere conservate per circa 15 giorni in frigorifero al buio.
Il terreno non aggiunto di TTC può essere sterilizzato in autoclave a 121°C per 10 minuti e quindi conservato in frigorifero: una volta scelto un modo di preparazione attenervisi sempre.
pH finale 7.2±0.2.
Impiego
Azide Maltose Agar, preparato secondo la formula di Kenner, Clark e Kabler, è un terreno selettivo utilizzato per l'isolamento ed il conteggio degli streptococchi fecali. APHA e FDA raccomandano il terreno nell'isolamento primario degli enterococchi (nel senso lato del termine) nelle acque e negli
alimenti con la tecnica della membrana filtrante o con il conteggio in piastra (agar-germi).
Su Azide Maltose Agar coltivano con colonie da rosse a rosa per la riduzione del TTC tutti gli streptococchi fecali considerati tali da Hartman: enterocchi di gruppo D (S. faecalis, S. faecalis subsp. liquefaciens, S. faecalis subsp. zymogenes, S. faecium), i non enterococchi di gruppo D (S. bovis, S. equinus) ed inoltre S. mitis e S. salivarius. Dopo 48 ore a 35°C si registra sul terreno una crescita scarsa con colonie incolori, di Lactobacillus plantarum e di Pediococcus cerevisiae; completamente inibiti sono gli streptococchi non di gruppo D (S. cremoris, S. lactis, S. pyogenes, S. termophilus) altri batteri acido lattici (Leuconostoc mesenteroides, L. lactis, L. acidophilus) ed i coliformi.
APHA nell'esame degli alimenti suggerisce di inoculare 1 ml delle diluizioni decimali del campione con la tecnica dell'agar germi e di incubare le piastre a 35°C per 48 ore. Per il test di conferma trapiantare 5-10 colonie tipiche in Brain Heart Infusion Broth e incubare a 35°C per 18-24 ore; usare queste brodocolture per una colorazione Gram, un test della catalasi, un trapianto in Aesculin Bile Broth, una semina in Brain Heart Infusion Broth normale (incubazione a 45°C) e addizionato di NaCI 6.5%. La diagnosi presuntiva di streptococco fecale è data da: catalasi negativa, sviluppo in brodo bile dopo 72 ore a 35°C, crescita a 45°C e in presenza a di NaCI. Tra gli streptococchi fecali considerati da APHA solo S. equinus, S. bovis non coltivano in presenza di NaCI 6.5%.

BRILLIANT GREEN BILE BROTH 2%

Formula (grammi per litro)
Ox Bile Bios 20.0000
Lactose 10.0000
Peptomeat 0.0000
Brilliant Green 0.013

Preparazione
Sciogliere 40 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda, riscaldare fino a soluzione, distribuire e autoclavare a 121°C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo e nella temperatura di sterilizzazione. Per un terreno 2X sciogliere 80 g di terreno in 1000 ml di acqua.
pH finale 7.2±0.2.

Impiego
Brilliant Green Bile Broth 2% è un terreno selettivo raccomandato per la determinazione e la conferma dei coliformi nelle acque, nei liquami, nei prodotti lattiero-caseari, negli alimenti. La presenza del verde brillante sopprime la crescita dei batteri anaerobi lattosio-fermentanti (C/ostridium perfringens) non ottenendosi falsi positivi con incubazione a 44°C; il verde brillante ed i sali biliari inibiscono la crescita dei microrganismi Gram positivi. Nella rassegna dei metodi per la determinazione dei coliformi negli alimenti ICMSF suggerisce l'uso del Brilliant Green Bile Broth 2% per la determinazione, con il metodo del numero più probabile, dei coliformi totali con incubazione a 35-37°C per 24 e 48 ore, seguito dal test di conferma su piastre di Violet Red Bile Agar o di Endo Agar incubate a 35-37°C per 48 ore; questo metodo è soprattutto utilizzato nei laboratori europei.
ICMSF in conformità ad APHA ed a FDA consiglia l'uso del Brilliant Green Bile Broth 2% nel test di conferma dei coliformi: trasferire un'ansata di crescita microbica dai tubi positivi di Lauryl Pepto Bios Broth o di Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 35°C per 24 e 48 ore. La formazione di gas entro le 48 ore conferma la presenza dei coliformi nei tubi del test presuntivo in Lauryl Pepto Bios Broth. Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSF descrive l'uso del terreno al verde brillante nella determinazione dei coliformi fecali: trasferire un'ansata di crescita dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provette di Brilliant Green Bile Broth 2% e di Peptone Water ed incubare a 44±0.1°C; osservare lo sviluppo di gas nelle provette di Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 e 48 ore di incubazione ed eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24 ore in Peptone Water; le colture che producono gas e sono indolo positive sono da considerarsi coliformi di origine fecale.
Anche OMS raccomanda per le acque potabili l'uso del Brilliant Green Bile Broth 2% per il test di conferma dei coliformi con incubazioni differenziate a 37°C ed a 44°C per rispettivamente 48 e 6-4 ore per la distinzione tra coliformi e coliformi fecali; il test di conferma segue la semina preliminare
in Lactose Broth o in Mac Conkey Broth e precede il test di verifica finale in terreno solido (Endo Agar o Levine EMB Blue Agar o Mac Conkey Agar OMS).

ENDO BROTH MEMBRAN FILTER

Preparazione
Sciogliere 48 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda contenente 20 ml di etanolo, mescolare e portare all'ebollizione. Non autoclavare. Il terreno deve essere usato il giorno stesso della sua preparazione; se necessario conservare al buio a 4°C per non più di 96 ore.
pH finale 7.2±0.2.

Impiego
Endo Broth Membran Filter è un terreno selettivo per il conteggio dei coliformi nell'acqua e nel latte con la tecnica della membrana filtrante.
Per l'esecuzione del metodo si consiglia di seguire le indicazioni dell'APHA. I coliformi coltivano con viraggio del terreno verso il color porpora con o senza riflessi metallici in superficie. Il volume di campione da filtrare deve essere scelto in base al numero di cellule batteriche che si attende di trovare.
La quantità ideale è quella che fornisce una crescita microbica compresa tra 50 e 200 colonie.
Ad eccezione delle acque potabili e delle acque delle piscine che devono essere filtrati in duplicato ad un unico volume di 100 o 500 ml, tutti gli altri campioni di acqua devono essere filtrati a tre diversi livelli volumetrici, diluiti o non diluiti, (Si veda la tabella sottostante).
Volumi da filtrare per il conteggio dei coliformi nelle acque:

Per le acque potabili l'arricchimento preliminare del campione dà risultati eccellenti, anche se esso non è indispensabile per l'esame di routine dei campioni.

EOSINE METHYLENE BLUE AGAR

Preparazione
Sciogliere 42.5 g di polvere in 1000 mi di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire e sterilizzare a 121°C per 15 minuti.
Raffreddare il terreno a circa 50°C e, prima di trasferirlo in piastra, agitare delicatamente per disperdere il materiale flocculante che si forma durante la sterilizzazione.
pH finale 7.2±0.2.

Impiego
Eosine Methylene Blue Agar è un terreno differenziale preparato secondo una modificazione del terreno originale di Halt-Harris e Teague, da usarsi in piastra per l'isolamento degli enterobatteri e per la differenziazione dei microrganismi lattosio-Saccarosio fermentanti.
I batteri Gram-positivi sono notevolmente inibiti. La combinazione dell'eosina e del blu di metilene nel terreno, contenente lattosio e saccarosio, permette di distinguere i membri dei generi Escherichia e Enterobacter dagli altri enterobatteri.
I batteri lattosio-saccarosio fermentanti sull'EMB Agar formano colonie mucoidali e convesse con una colorazione da rosso a porpora con assenza o presenza di riflessi metallici. Salmonella, Shigella e gli altri batteri lattosio-saccarosio non fermentanti formano colonie da incolori a rosa.
La presenza del tampone fosfato nel terreno permette di distinguere E. coli da E. aerogenes; E. coli anche in presenza di un sistema tampone, produce una notevole acidificazione del terreno, mentre E. aerogenes, avendo modeste proprietà fermentanti, provoca una minore acidificazione del terreno. L'abbassamento del p H durante la crescita di E. coli induce la formazione di legami amidici tra l'eosina e il blu di metilene che si traduce in una colorazione porpora metallica delle colonie. Per l'isolamento degli enterobatteri patogeni si consiglia di utilizzare, parallelamente all'EMB Agar, terreni più selettivi quali l'XLD, il Brilliant Green Agar, ecc.
Nella tabella sottostante sono riportate le caratteristiche colturali di alcuni microrganismi su EMB Agar:

ETHYL VIOLET AZIDE BROTH

Preparazione
Sciogliere 35.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completo scioglimento del terreno, distribuire in provette ed autoclavare , a 121°C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo di sterilizzazione.
pH finale 7.0±0.2.

Impiego
Ethyl Violet Azide Broth è un terreno selettivo per la determinazione degli enterococchi nelle acque, come indice di un inquinamento fecale delle stesse. Il terreno è preparato secondo una modificazione della formula originale proposta da Litsky ed è in accordo con le specificazioni dell'APHA riguardo all'uso delle tecniche per la determinazione degli streptococchi fecali nelle acque.
L'uso dell'azide sodica, associata al violetto di etile, rende il terreno selettivo per gli enterococchi essendo inibiti tutti gli altri microrganismi Gram-positivi ed i microrganismi Gram-negativi.
Gli enterococchi che si devono considerare come indicatori di inquinamento fecale sono: Streptococcus faecalis subsp. liquefaciens, Streptococcus faecalis subsp. zymogenes, Streptococcus faecium, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus.
Le caratteristiche di crescita di questi microrganismi, resistenza alle alte temperature, ai detergenti, ai disinfettanti, fanno si che l'indice di inquinamento da loro espresso debba essere integrato dalla ricerca di altri indicatori faecali (coliformi).
APHA consiglia di utilizzare l'Ethyl Violet Azide Broth per il test di conferma degli enterococchi coltivati nei tubi di Azide Broth. Dopo 24-48 ore di incubazione delle provette di Azide Broth si trasferiscono tre ansate di crescita microbica in tubi contenenti 10 ml di Ethyl Violet Azide Broth e si incuba per 24 ore a 35°C.
La presenza di enterococchi è rivelata dall'intorbidimento del brodo e dalla formazione di un anello porporino attorno al menisco del liquido.

FAECAL COLIFORM BROTH

Impiego
Faecal Coliform Broth, preparato in in accordo alla formula proposta da APHA, è utilizzato per il conteggio dei coliformi fecali nell'acqua con il metodo delle membrane filtranti. Per l'esecuzione del test filtrare un volume opportuno di campione d'acqua (si veda la tabella sottostante) e depositare i filtri sui tamponi impregnati di Faecal Coliform Broth in piastre Petri. Entro 30 minuti deporre in bagnomaria termostatato a 44-45°C e incubare in contenitori a tenuta per 24 ore. I coliformi fecali coltivano con colonie blu, le rare colonie date dai coliformi non fecali appaiono di colore grigio-crema. Per il conteggio delle colonie si consiglia di utilizzare un microscopio a basso potere d'ingrandimento (10-15 ingrandimenti).
Volumi da filtrare per il conteggio del coliformi fecali nelle acque:

GELATIN BIOS

LACTOSE BROTH

Formula (grammi per litro)
Beef Extract 3
Peptocomplex 5
Lactose 5
Preparazione
Sciogliere 13 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire in tubi Durham ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Se necessario, usare il terreno a doppia o tripla concentrazione.
pH finale 6.8±0.2.
Impiego
Lactose Broth è consigliato da APHA per la determinazione presuntiva dei coliformi con il metodo del numero più probabile, nelle acque e nei liquami, per eseguire il test finale di conferma dei coliformi nei prodotti lattiero caseari dopo la semina in Endo Agar o in Levine EMB Blue Agar ed è consigliato da FDA e ICMSF per l'arricchimento non selettivo di SaJmonella.
Il terreno contiene lattosio, estratto di carne e peptone in quantità tali da permettere una crescita ottimale dei microrganismi non particolarmente esigenti quali sono i coliformi.
Per la determinazione presuntiva dei coliformi nelle acque APHA suggerisce la seguente tecnica:
inoculare una serie di tubi da fermentazione con volumi appropriati di campione in modo da non alterare il rapporto tra volume finale di terreno inoculato e ingredienti per litro; ogni variazione rispetto allo schema di lavoro consigliato e riportato nella tabella sottostante, può alterare le caratteristiche biologiche del terreno.

Incubare i tubi da fermentazione a 35°C ed eseguire una prima lettura agitando leggermente le provette dopo 24 ore; se non si osserva produzione di gas incubare per ulteriori 24 ore.
La formazione di gas entro le 48 ore è indice di positività per i coliformi. Il limite arbitrario di 48 ore può escludere la possibilità di coltivare occasionali coliformi che fermentano lentamente il lattosio, i quali comunque hanno scarso interesse sanitario e non inficiano la validità del metodo.
Confermare il test presuntivo con semine dai tubi positivi di Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% e ricercare, se necessario, i coliformi fecali con semine in EC Medium.
La presenza di coliformi nelle acque è considerata indice di inquinamento fecale; il loro ritrovamento in prodotti lattiero caseari è indice di cicli produttivi non rigorosamente controllati da un punto di vista sanitario e/o di modalità di conservazione non idonee.

M17 AGAR

Preparazione
Sciogliere 57 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire beuta ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Non eccedere nella temperatura di ebollizione. L'acidità del terreno può idrolizzare parzialmente l'agar.
pH finale 6.8±0.2.

Impiego
Il terreno M17 è selettivo per l'identificazione di Sterptococcus thermophilus.

MRS BROTH

Formula (grammi per litro)
Peptomeat 10.00
Beef Extract 10.00
Yeast Extract 5.00
Glucose 20.00
Dipotassium Phosphate 2.00
6odium Acetate 5.00
Triammonium Citrate 2.00
Magnesium Sulphate 0.20
Manganous Sulphate 0.05

Preparazione
Sciogliere 69.2 g di agar e 54.2 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, aggiungere 1 ml di polisorbato 80 (Tween), distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 6.4±O.2.

Impiego
MRS Agar e Broth, preparati secondo la formula di De Man, Rogosa e Sharpe, sono terreni selettivi indicati per l'isolamento dei lattobacilli.
Sui due terreni coltivano lattobacilli provenienti da qualsiasi materiale: latte, prodotti lattiero caseari, cavo orale, feci, ed inoltre i lattobacilli normalmente difficili da coltivare su altri terreni (Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum).
De Man e coll. riportano una migliore rispondenza dell'MRS Agar rispetto ai terreni contenenti estratto di pomodoro di Briggs e di Cox Briggs e al terreno all'estratto di carne di De Man, nell'isolamento dei lattobacilli.
Il Tween 80, il sodio acetato e il triammonio citrato intensificano la crescita dei lattobacilli; il magnesio solfato è inserito per motivi precauzionali poiché lo Yeast Extract dovrebbe fornire una quantità di magnesio sufficiente alla crescita dei lattobacilli. Per l'isolamento dei lattobacilli operare come segue: inserire 1 mi delle diluizioni decimali del campione in piastre Petri e addizionare 10-15 ml di terreno, lasciar solidificare e addizionare un secondo strato di MRS Agar non inoculato e incubare a 37°C per 3 giorni o a 30°C per 5 giorni. Le colonie coltivate su MRS Agar o la crescita in MRS Broth devono essere sottoposte ai tests biochimici per l'identificazione dei lattobacilli in MRS Aesculin Broth, MRS Arginine Broth ed in MRS Fermentation Broth.

MUELLER HINTON MEDIUM

MUELLER HINTON BROTH

Preparazione
Sciogliere 36 g di agar e 21 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione l'agar e scaldare fino a completa soluzione il brodo, distribuire ed autoclavare a 115°C per 10 minuti.
Non superare il tempo e la temperatura di sterilizzazione indicati.
pH finale 7.4±0.2.

Impiego
Mueller Hinton Medium e Broth sono terreni originariamente preparati per l'isolamento dei meningococchi e dei gonococchi e trovati indicati, dato i bassi livelli di acido p-aminobenzoico per il test di sensibilità ai sulfamidici.
Mueller Hinton Medium è raccomandato da FDA per il test di sensibilità agli antibiotici chemioterapici con il metodo dell'agar diffusione utilizzando dischi di carta da 6 mm ad alta concentrazione.

Mueller Hinton Medium è preparato con peptoni rigorosamente selezionati, contenenti bassi livelli di agenti inibitori dei sulfamidici e del co-trimossazolo, tanto che è possibile effettuare l'antibiogramma senza ricorrere all'utilizzo del sangue lisato di cavallo per neutralizzare l'azione della timidina antagonista del trimetoprim nell'associazione trimetoprim-sulfametossazolo. Il contenuto di cationi bivalenti (Ca++, Mg++) del terreno è entro l'intervallo di valori suggerito da Reller e coll. (Ca++: 50-100 mg/l; Mg++: 20-35 mg/l), cosicché gli aloni di inibizione da aminoglucosidi su Pseudomonas aeruginosa risultano entro il range raccomandato da ASM e riportati in tabella.
Nell'esecuzione dell'antibiogramma secondo il metodo di Bauer e coll. e raccomandato da FDA utilizzare il Mueller Hinton Medium in piastre da 14 cm o da 10 cm, in strato di 4 mm (60 ml di terreno per piastre Ø 140 mm 25 ml per piastre Ø 100 mm); addizionare sangue defibrinato di montone o di cavallo al 4-5% per eseguire l'antibiogramma su specie batteriche particolarmente esigenti (streptococchi, pneumococchi) e utilizzare l'agar cioccolato con gli emofili.
Per preparare l'inoculo sospendere 4-5 colonie coltivate su terreno primario d'isolamento in 4-5 ml di Tryptic Soy Broth e incubare per 2-6 ore fino a che la brodocoltura raggiunga la stessa densità dello standard opacimetrico preparato aggiungendo a 99.5 ml di acido solforico 0.36 N, 0.5 ml di bario cloruro 1 %. Entro 15 minuti dalla preparazione dell'inoculo immergere un tampone sterile nella brodocoltura, spremerlo contro le pareti della provetta per eliminare l'eccesso di liquido quindi strisciare sulla superficie dell'agar in piastra in modo da ottenere una dispersione uniforme dell'inoculo.
Lasciare asciugare le piastre quindi depositare i dischi di carta premendoli sulla superficie dell'agar con la punta dell'ago; depositare un massimo di 5 dischi nelle piastre Ø 100 mm e un massimo di 9 dischi nelle piastre Ø 140 mm in modo tale che tra i dischi e il bordo della piastra vi siano non meno di 2 cm. Incubare 18 ore a 35°C quindi leggere gli aloni di inibizione tenendo conto della zona completamente priva di crescita microbica e con bordi netti. Essendo numerose le variabili del metodo dell'agar diffusione che giocano un ruolo fondamentale per l'ottenimento di risultati precisi ed accurati (inoculo, strato dell'agar, temperatura di incubazione, contenuto dei dischi, etc.), è indispensabile stabilire un programma per il controllo di qualità del metodo. Per tale scopo si utilizzano due ceppi: Staphylococcus aureus, Escherichia coli; questi ceppi devono essere inseriti di routine nella procedura operativa, ogni volta che si esegue l'antibiogramma.

NUTRIENT AGAR

Preparazione
Sciogliere 23 g di agar e 8 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 6.8±0.2.

Impiego
Nutrient Agar e Nutrient Broth sono terreni a base di peptoni di carne utilizzati per la coltivazione dei microrganismi non particolarmente esigenti sotto il profilo delle richieste nutritive.
Il Beef Extract e il Peptomeat forniscono una quantità di carbonio, azoto e vitamine sufficienti per la crescita della maggior parte dei microrganismi non esigenti (enterobatteri, stafilococchi).
L'APHA raccomanda l'uso di Nutrient Agar nell'esame microbiologico delle acque e dei prodotti lattiero caseari. I terreni possono essere impiegati come base a cui aggiungere vari materiali quali carboidrati, sali, coloranti ecc., per ottenere terreni selettivi, differenziali, d'arricchimento. Il Nutrient Agar e il Nutrient Broth, sono stati tra i primi terreni utilizzati in microbiologia e tuttora possono essere usati di routine per l'esame a delle acque, degli alimenti, per preparare colture stock, per la coltivazione preliminare di un campione da sottoporre a successivi esami batteriologici, per l'isolamento dei microrganismi in coltura pura.

O/F HUGH LEIFSON BASE

Impiego
O/F Hugh Leifson Base preparato in accordo alla formula proposta da Hugh e Leifson è un terreno a cui possono essere aggiunti vari carboidrati per lo studio delle ossidazioni e/o fermentazioni dei microrganismi.
Il terreno è usato per la differenziazione della flora intestinale non enterica, Gram negativa dagli enterobatteri, per la differenziazione dei micrococchi e per la determinazione del modello metabolico con cui vengono degradati gli zuccheri dai microrganismi.
L'utilizzo dei carboidrati da parte dei batteri può avvenire secondo due processi: fermentativo o ossidativo.
Alcuni microrganismi sono capaci di utilizzare i carboidrati con produzione di acido solamente in condizioni aerobie, altri in condizioni sia aerobie che anaerobie (anaerobi facoltativi). La degradazione anaerobia dei carboidrati avviene attraverso la via metabolica di Embden Meyerhof o attraverso una combinazione di questa con lo " shunt " dei pentosi con la via di Entner Doudoroff; tutte e tre le vie metaboliche richiedono la fosforilazione iniziale del glucosio, hanno come prodotto intermedio l'acido piruvico, richiedono un composto organico come acettore ultimo di elettroni e conducono a metaboliti finali diversi essendo diverso il patrimonio enzimatico delle varie specie batteriche.
La degradazione ossidativa del glucosio non richiede la sua fosforilazione iniziale, ha come prodotto intermedio l'acido piruvico e richiede l'ossigeno o un composto inorganico, come acettore finale di elettroni.
L'O/F Medium Base, addizionato del carboidrato adatto, permette di distinguere tra i due processi metabolici descritti.
Il terreno contiene il blu di bromotimolo come indicatore di pH; una variazione del pH del mezzo verso l'acidità, indotta dalla degradazione del carboidrato aggiunto, fa virare l'indicatore da verde a giallo. Il permanere, dopo l'incubazione, di una colorazione verde del terreno o l'apparizione di una colorazione blu, dovuta ad una trasformazione alcalina del mezzo, indicano che il test è negativo e che non vi è stata nessuna degradazione dei carboidrati.
Il terreno ha un basso contenuto di peptoni per evitare una loro degradazione da parte dei microrganismi con metabolismo ossidativo, che porterebbe alla formazione di prodotti finali di natura alcalina che potrebbero mascherare l'acidità del mezzo.
O/F Hugh Leifson Base è un terreno semisolido; la presenza dell'agar a una concentrazione del 0.25% impedisce ai prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con una conseguente loro diluizione.
Il dipotassio fosfato è incorporato per promuovere la fermentazione dei carboidrati e per stabilizzare il pH del terreno, mentre il sodio cloruro stimola la crescita di Brucella.
II glucosio è il carboidrato che più frequentemente viene usato per il test O/F; Cowan e Steel comunque raccomandano di usare, per la differenziazione dei microrganismi che non degradano il glucosio, una batteria di zuccheri costituita da glucosio, lattosio, saccarosio, maltosio.
Per l'esecuzione del test si inoculano due provette, contenenti il carboidrato alla concentrazione dell'1 %, per infissione di un ago caricato di una sospensione batterica. Dopo aver ricoperto una delle provette con olio di vasellina si incuba per 48 ore o più a 37°C.
I microrganismi con metabolismo ossidativo produrranno un'acidificazione del mezzo, con viraggio dell'indicatore da verde a giallo, nella provetta aperta; i batteri con metabolismo fermentativo produrranno un'acidificazione del terreno in entrambe le provette.
Con il test O/F si può determinare anche la produzione di gas da parte dei microrganismi e la loro mobilità (crescita diffusa a partire dalla linea dell'inoculo).
Nelle tabelle sottostanti sono indicati i modelli di reazione su O/F Hugh Leifson Base, e le caratteristiche colturali di alcuni microrganismi su detto terreno.

MODELLI DI REAZIONE SU O/F HUGH LEIFSON BASE

CARATTERISTICHE COL TURALI DI ALCUNI BATTERI SU O/F HUGH LEIFSON BASE

+ reazione positiva, acidificazione con viraggio al giallo dell'indicatore
- reazione negativa, nessun cambiamento di colore del mezzo

PEPTONE WATER

Preparazione
Sciogliere 15 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Riscaldare agitando, distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Per studi sull'utilizzazione degli zuccheri aggiungere, prima della sterilizzazione, a 900 ml di terreno, 100 ml di una soluzione acquosa allo 0.2% di un indicatore (porpora bromocresolo, blu bromotimolo o rosso fenolo).
Aggiungere alla base sterilizzata una soluzione sterile dello zucchero desiderato e distribuire in tubi con campanella oppure addizionare alle provette dischi di carta contenenti carboidrati.
L'aggiunta di alcuni zuccheri può produrre un abbassamento del pH del terreno: in questo caso ricorreggere il pH con NaOH 0.1 N sterile.
pH finale 7.2±0.2.

Impiego
Peptone Water, dato l'elevato contenuto in triptofano del Peptone Bios D, è particolarmente adatto come substrato per .la determinazione della produzione di indolo.
La capacità di metabolizzare il triptofano con formazione di indolo è caratteristica distintiva di alcune specie batteriche; il test è perciò utile ai fini dell'identificazione e classificazione dei microrganismi.
Il tempo e la temperatura di incubazione variano a seconda della specie batterica in esame; la presenza di indolo può essere rivelata con il reattivo di Kovacs o di Erlich.
Il metodo prescelto deve essere controllato con ceppi di collezione: Escherichia coli indolo +, Enterobacter aerogenes indolo -.
Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSF suggerisce l'uso di Peptone Water nel test di conferma dei coliformi fecali negli alimenti: trasferire un'ansata di crescita microbica dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provette di Peptone Water e di Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 44°C; eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24 ore in Peptone Water e osservare lo sviluppo di gas in Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 ore e 48 ore. Le colture che a 44°C sono indolo positive e producono gas sono da considerarsi coliformi di origine fecale. Peptone Water è anche utilizzato come base per lo studio della utilizzazione degli zuccheri. Dopo l'aggiunta degli zuccheri incubare alla temperatura desiderata e osservare tutti i giorni per 7 giorni se vi è stata produzione di gas e/o di acido.

PHENOL RED AGAR BASE

PHENOL RED BROTH BASE
Formula (grammi per litro)
Peptomeat 10.000
Beef Extract 3.000
Sodium Chloride 5:000
Phenol Red 0.018

Preparazione
Sciogliere 31 g di agar e 18 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire in tubi da fermentazione il brodo in ragione di 3-4 ml per tubo, e in beuta l'agar, autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Raffreddare a circa 50°C ed aggiungere con le precauzioni dell'asepsi una soluzione sterilizzata per filtrazione dell'appropriato carboidrato, in modo che si ottenga una concentrazione finale dell'1-2% (p/v).
Per evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili si può addizionare in provetta (brodo) o deporre sulla superficie dell'agar in piastra, dischi di carta contenenti carboidrati
pH finale 7.4±0.1

Impiego
Phenol Red Agar Base e Broth Base sono terreni contenenti un indicatore di pH utilizzati per lo studio delle fermentazioni dei carboidrati rispettivamente con il metodo in terreno solido e con il metodo in terreno liquido. Phenol Red Broth Base è preparato in accordo alla formula raccomandata da AOAC e da ICMSF per lo studio della fermentazione dei carboidrati con il metodo preparato da "International Committe on Enterobacteriaceae"; Phenol Red Agar Base è preparato in accordo alla formula raccomandata da APHA. Per l'identificazione e la classificazione delle specie batteriche si fa spesso ricorso a prove biochimiche che ne studiano il metabolismo glucidico.
Tali prove, che vanno sotto il nome generico di "prove di fermentazione degli zuccheri", anche se a volte vengono eseguite su microrganismi a metabolismo prevalentemente ossidativo e se fanno uso di carboidrati che non sono solo zuccheri ma anche alcoli e glucosidi, consistono nel seminare il germe in esame, in coltura pura, in terreni contenenti vari carboidrati.
Phenol Red Agar Base e Broth, contengono il rosso fenolo come indicatore di pH che, da rosso, in terreno alcalino, diventa arancio in terreno neutro e giallo in terreno reso acido dall'attacco dei carboidrati da parte dei microrganismi.
Metodo in terreno solido con dischi di carta (Bios Discs)
Dividere il terreno autoclavato in piastre sterili (Ø 14 mm), lasciar solidificare indi seminare in superficie il germe in esame. Per ottenere risultati più rapidi e più netti ricorrere alla tecnica dell'agar-germi. Deporre i Bios Discs sulla superficie dell'agar inoculato, facendo attenzione che siano opportunamente distanziati e ben aderenti al terreno (seminare anche una piastra di controllo senza carboidrati) incubare a 37°C. La produzione di acido è segnalata da un alone di viraggio giallo attorno ai dischi.
Metodo in terreno liquido con dischi di carta (Bios Discs)
Nelle provette di Phenol Red Broth Base autoclavate, introdurre sterilmente i Bios Discs e inoculare con un'ansata di crescita microbica. Seminare anche una provetta di controllo senza carboidrati e incubare a 37°C. La produzione di acido è segnalata dal viraggio al giallo del brodo di coltura. Con entrambi i terreni la produzione di acido è rapida, è bene quindi eseguire letture frequenti, la prima dopo circa 4 ore. Dopo che si è osservata una reazione positiva scartare il tubo; prolungando infatti il periodo di incubazione si può assistere ad un'inversione della reazione con viraggio dell'indicatore verso l'alcalinità.

TRIPTIC GLUCOSE EXTRACT AGAR

TRIPTIC GLUCOSE YEAST AGAR (Plate count agar)
Formula (grammi per litro)
Peptone Bios D 5.0
Yeast Extract 2.5
Glucose 1.0
Agar Bios LL 15.0

Preparazione
Sciogliere 24 g di Tryptic Glucose Extract Agar e 23.5 g di Tryptic Glucose Yeast Agar in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 7.0±0,2.

Impiego
Tryptic Glucose Extract Agar e Tryptic Glucose Yeast Agar sono terreni d'uso generale raccomandati da APHA, ICMSF, AOAC per il conteggio dei microrganismi con la tecnica dell'agar germi, utilizzato in passato per la conta microbica totale nel latte e prodotti lattiero caseari, Tryptic Glucose Extract Agar è ora raccomandato da APHA insieme al Tryptic Glucose Yeast Agar, solo per il conteggio dei microrganismi nelle acque e negli alimenti, Tryptic Glucose Yeast Agar, corrispondente al Plate Count Agar (Standard Methods Agar) di APHA, AOAC, ICMSF, è il terreno d'elezione per il conteggio dei microrganismi aerobi e di quelli anaerobi facoltativi eterotrofi, nell'acqua, latte, prodotti lattiero caseari, alimenti.
Lo schema di lavoro da seguire per effettuare la conta microbica su ciascun tipo di materiale deve essere il più possibile conforme a quanto raccomandato dagli organismi ufficiali citati. Il metodo dell'APHA consiste nel preparare diverse diluizioni del campione in esame; a 1 ml di ciascuna diluizione in piastre Petri viene aggiunto in duplicato uno dei due terreni al 44-46°C. Dopo aver mescolato l'inoculo con agar si incuba per 48 ore a 32-35°C e quindi si contano le colonie coltivate, in quelle piastre in cui siano presenti da 30 a 300 colonie. Per il conteggio di microrganismi che richiedono altre temperature di crescita si incuba a 5-7°C per 10 giorni a 20°C per 3-5 giorni e a 45°C per 2-3 giorni.

TRYPTIC SOY AGAR

TRYPTIC SOY BROTH
Formula (grammi per litro)
Tryptic C~sein Bios D 17.0
Soy PeptoÌle 3.0
Sodium Ch.foride 5.0
Dipotassium Phosphate 2.5
Glucose 2.5

Preparazione
Sciogliere 40 g di agar e 30 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire e autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 7.3±0.2.

Impiego
Tryptic Soy Agar e Tryptic Soy Broth sono terreni d'uso generale che supportano la crescita di una larga varietà di microrganismi.
Per le loro caratteristiche nutrizionali; per l'assenza di inibitori, per la possibilità di essere supplementati con i composti più svariati, i due terreni si prestano bene per l'isolamento dei patogeni, per lo studio dei microrganismi a crescita fastidiosa, per il mantenimento dei ceppi di collezione, per la preparazione di autovaccini, per l'esecuzione dell'antibiogramma.
Il sangue è l'additivo più comune per il Tryptic Soy Agar e viene aggiunto a concentrazioni variabili tra il 5 e i115% come sangue defibrinato (di coniglio, cavallo, montone, uomo).
In alcuni casi (isolamento di Neisseria e di Haemophilus) il sangue viene aggiunto come tale al terreno e poi riscaldato a 80°C per 10 minuti ottenendo così l'agar cioccolato.
Tryptic Soy Agar è comunemente usato per il conteggio dei germi presenti nelle urine e negli espettorati ed in microbiologia alimentare per la conta dei microrganismi presenti nel latte, carni, alimenti conservati, ecc.
Tryptic Soy Broth è utilizzato per la coltivazione di microrganismi aerobi, aerobi facoltativi, inclusi alcuni funghi e, aggiunto d'agar a concentrazioni 0.1-0.2% per la coltivazione degli anerobi obbligati.